Jaoimme viime viikolla useita näkökohtia selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesin käyttämisestä, ja lopetamme tämän aiheen täällä tänään viitteellesi.
Valinta Puskurin pitoisuus
Selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesissa käytetty puskuripitoisuus on yleensä pienempi kuin paperielektroforeesissa käytetty puskuripitoisuus. Yleisesti käytetty pH 8,6BArbitaalipuskuri valitaan tyypillisesti alueelta 0,05 mol/l - 0,09 mol/l. Konsentraatiota valittaessa tehdään alustava määritys. Esimerkiksi, jos kalvonauhan pituus elektrodien välillä elektroforeesikammiossa on 8-10 cm, tarvitaan 25 V jännite kalvon pituuden senttimetriä kohti ja virran voimakkuuden tulee olla 0,4-0,5 mA kalvon leveyden senttimetriä kohti. Jos näitä arvoja ei saavuteta tai ylitetä elektroforeesin aikana, puskurikonsentraatiota tulee suurentaa tai laimentaa.
Liian alhainen puskuripitoisuus johtaa nauhojen nopeaan liikkeeseen ja kaistan leveyden kasvuun. Toisaalta liian korkea puskuripitoisuus hidastaa vyöhykkeiden siirtymistä, mikä vaikeuttaa tiettyjen erotusvyöhykkeiden erottamista.
On huomattava, että selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesissa merkittävä osa virrasta johdetaan näytteen läpi, mikä tuottaa huomattavan määrän lämpöä. Joskus valittua puskuripitoisuutta voidaan pitää sopivana. Kuitenkin kohonneessa ympäristön lämpötilassa tai korkeampaa jännitettä käytettäessä lämmön aiheuttama veden haihtuminen voi voimistua, mikä johtaa liian suureen puskuripitoisuuteen ja jopa kalvon kuivumiseen.
Näytteen tilavuus
Selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesissa näytetilavuuden määräävät useat tekijät, mukaan lukien elektroforeesiolosuhteet, itse näytteen ominaisuudet, värjäysmenetelmät ja detektiotekniikat. Yleisenä periaatteena on, että mitä herkempi havainnointimenetelmä, sitä pienempi näytetilavuus voi olla, mikä on edullista erottamisen kannalta. Jos näytetilavuus on liian suuri, elektroforeettiset erotuskuviot eivät ehkä ole selkeitä, ja värjäys voi myös olla aikaa vievää. Kuitenkin, kun erotettuja värjäytyneitä vyöhykkeitä analysoidaan kvantitatiivisesti eluointikolorimetrisillä detektiomenetelmillä, näytetilavuuden ei tulisi olla liian pieni, koska se voi johtaa tiettyjen komponenttien pienempiin absorbanssiarvoihin, mikä johtaa suurempiin virheisiin niiden sisällön laskennassa. Tällaisissa tapauksissa näytteen määrää on lisättävä asianmukaisesti.
Tyypillisesti näytteen annostelulinjan jokaiselle senttimetrille lisättävä näytemäärä on 0,1 - 5 μL, mikä vastaa 5 - 1 000 μg:n näytemäärää. Esimerkiksi rutiininomaisessa seerumin proteiinielektroforeesianalyysissä kullekin levityslinjan senttimetrille lisättävä näytemäärä ei yleensä ylitä 1 µl, mikä vastaa 60–80 µg proteiinia. Kuitenkin, kun lipoproteiineja tai glykoproteiineja analysoidaan samalla elektroforeesimenetelmällä, näytetilavuutta on lisättävä vastaavasti.
Yhteenvetona voidaan todeta, että sopivin näytetilavuus tulisi valita tiettyjen olosuhteiden perusteella sarjan alustavien kokeiden avulla.
Värjäysliuoksen valinta
Selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesissa erotetut juovat värjätään tyypillisesti ennen havaitsemista. Eri näytekomponentit vaativat erilaisia värjäysmenetelmiä, ja selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesiin sopivat värjäysmenetelmät eivät välttämättä sovellu täysin suodatinpaperiin.
Värjäysratkaisun valinnassa on kolme pääperiaatettaselluloosa-asetaattikalvo. EnsinnäkinVesiliukoisia väriaineita tulee suosia alkoholiliukoisten värien sijaan, jotta vältetään kalvon kutistuminen ja jälkimmäisen värjäysliuoksen aiheuttama muodonmuutos. Värjäyksen jälkeen on tärkeää huuhdella kalvo vedellä ja minimoida värjäytymisaika. Muuten kalvo voi käpristyä tai kutistua, mikä voi vaikuttaa myöhempään havaitsemiseen.
Toiseksi on suositeltavaa valita väriaineet, joilla on vahva värjäytysaffiniteetti näytteelle. Seerumiproteiinien selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesissa käytetään yleisesti aminomustaa 10B:tä, koska se on vahva värjäysaffiniteetti eri seerumin proteiinikomponentteihin ja sen stabiilisuus.
Kolmanneksi on valittava luotettavat laadukkaat väriaineet. Jotkut väriaineet, vaikka niillä on sama nimi, voivat sisältää epäpuhtauksia, jotka johtavat erityisen tummaan taustaan värjäyksen jälkeen. Tämä voi jopa hämärtää alunperin hyvin erotetut nauhat, jolloin niitä on vaikea erottaa.
Lopuksi värjäysliuoksen pitoisuuden valinta on tärkeä. Teoreettisesti saattaa vaikuttaa siltä, että korkeampi värjäysliuospitoisuus johtaisi näytteen komponenttien perusteellisempaan värjäämiseen ja parempiin värjäystuloksiin. Näin ei kuitenkaan ole. Näytekomponenttien ja väriaineen välisellä sitoutumisaffiniteetilla on tietty raja, joka ei kasva värjäysliuospitoisuuden kasvaessa. Päinvastoin, liian korkea värjäysliuospitoisuus ei ainoastaan tuhlaa väriä, vaan vaikeuttaa myös selkeän taustan saavuttamista. Lisäksi kun värin intensiteetti saavuttaa tietyn maksimiarvon, väriaineen absorbanssikäyrä ei noudata lineaarista suhdetta etenkään kvantitatiivisissa mittauksissa. Selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesissa värjäysliuoksen pitoisuus on yleensä pienempi kuin paperielektroforeesissa käytetty.
Lisätietoa Beijing Liuyi -bioteknologiasta's selluloosa-asetaattikalvoelektroforeesisäiliö ja sen elektroforeesisovellus, käy täällä:
lKoe seerumiproteiinin erottamiseksi selluloosa-asetaattikalvolla
lSelluloosaasetaattikalvoelektroforeesi
Jos sinulla on ostosuunnitelma tuotteillemme, älä epäröi ottaa meihin yhteyttä. Voit lähettää meille viestin sähköpostitse[sähköposti suojattu]tai[sähköposti suojattu], tai soita meille numeroon +86 15810650221 tai lisää Whatsapp +86 15810650221 tai Wechat: 15810650221.
Viite:Elektroforeesi (toinen painos), kirjoittanut Mr. Li
Postitusaika: 06.06.2023